艾滋病毒与逆转录病毒杂志 开放获取

抽象的

建立中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）的强毒全长 cDNA 克隆

朱龙超

MERS-CoV感染性克隆是研究病毒蛋白功能和病毒-宿主相互作用的重要平台。本研究采用基于Ⅱ类酶切位点BsmBI的无缝克隆技术，构建了适应Vero细胞的MERS-CoV感染性cDNA克隆(MERS-CoV-HKU)。将其基因组分成12个连续片段，经BsmBI侧翼PCR扩增。这些片段进一步利用内切酶BsmBI消化形成的独特连接，经过两轮克隆，组装成细菌人工染色体(BAC)。通过沉默突变去除基因组内的两个BsmBI酶切位点，将其设为icMERS-CoV-HKU的分子标记。最后，在BAC中CMV启动子下游回收了一个全长的MERS-CoV-HKU。

与野生型HCoV-EMC/2012株相比，感染性克隆株回收的MERS-CoV-HKU在Vero和Huh7细胞中滴度较高。基因分析发现，非结构蛋白（nsp2、nsp3、nsp14、nsp16）和结构蛋白（Spike、ORF5、N）发生了基因修饰。同义突变位于nsp2（A2169C）、nsp3（C6172T、A6954G）、nsp14（C19514T）、nsp16（T21423G）、S（A22367G、T24093A）和N（T29149A）。在nsp3(C6172T、A6954G)、S(C25217T)、N(A29574T)中发现非同义突变，导致nsp3(T198I、D1702Y)、S(S1251F)、N(S192T)中氨基酸突变，更令人吃惊的是，在S2和ORF5区分别发现了3个氨基酸‘SHY’插入和4个核苷酸‘TTTA’缺失。

根据前期研究，BatCoV-HKU4 和 BatCoV-HKU25 的 RBD 可以识别人类 DPP4 受体，但 BatCoV-HKU5 的 RBD 则不能。为了阐明 MERS-CoV 与 BatCoV 之间的关系，我们构建了 MERS-CoV 感染性克隆和嵌合型 MERS-CoV 感染性克隆，其中 MERS RBD 区域被 BatCoV-HKU4、BatCoV-HKU5 和 BatCoV-HKU25 的 RBD 区域所取代。我们进一步评估了重组 MERS-CoV 感染性克隆在 Vero 和 Huh7 细胞系中的复制情况。

我们的重组MERS-CoV感染性克隆已显示出在研究冠状病毒跨物种传播和发病机制中的关键作用。