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拉傑什

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幽門螺旋桿菌是一種革蘭氏陰性細菌，最早由Marshall和Warren從胃炎和消化性潰瘍患者的胃黏膜分離出來。幽門螺旋桿菌是胃黏膜慢性感染的主要原因，影響著全球50%的人口。最近，幽門螺旋桿菌已被證明會引起其他併發症，如胃潰瘍、十二指腸發炎和胃炎。根據文獻報告，有相當一部分感染幽門螺旋桿菌的患者可能不會發展為胃十二指腸疾病，並且可以長期保持無症狀。另一方面，長期感染會增加罹患腺癌和胃淋巴瘤等疾病的風險。

多項研究已證實幽門螺旋桿菌是最終的致癌劑。據估計，與幽門螺旋桿菌感染相關的死亡率為每 34 名受感染男性中有 1 例，每 60 名受感染女性中有 1 例。幽門螺旋桿菌產生大量的脲酶（佔總蛋白質重量的10% - 15%），這是幽門螺旋桿菌生存和發病所需的。許多酵素透過從尿素產生氨和碳酸鹽來降低幽門螺旋桿菌周圍環境的酸度。幽門螺旋桿菌脲酶是一種分子量為 550 kDa 的多聚體酶，由 UreA (29.5 kDa) 和 UreB (66 kDa) 兩個獨立的亞基收集。最近，研究人員一直在關注針對幽門螺旋桿菌感染的疫苗的開發。在各種候選抗原中，UreB 被認為是最有效的，因為與尿素不同，用純化的 UreB 免疫小鼠會產生更高的免疫原性和保護作用。選擇脲酶作為免疫標靶是基於膜蛋白經常引發免疫反應的事實。在本研究中，我們使用高效能的預測軟體程式進行表位作圖。透過B淋巴細胞的幾個彼此相鄰的特定表位，該程序選擇了UreB基因的氨基酸片段。此外，此抗原片段被表達並純化為大腸桿菌BL21(DE3)菌株的重組蛋白。本研究旨在利用相關軟體程式展示具有顯著抗原特性的重組 UreB (rUreB) 片段。

2. 目標

本研究的目的是提供一種重組載體，由來自幽門螺旋桿菌的 UreB 抗原區域組成，使用抗原的免疫顯性表位而不是大腸桿菌中的總序列和表達。此外，我們的目的是確定其作為候選疫苗的抗原性，並評估其在人類幽門螺旋桿菌感染血清學診斷中的功效。

3. 方法

3.1.細菌、質粒和其他試劑的製備

在這項研究中，幽門螺旋桿菌是從接受常規診斷內視鏡檢查的消化不良患者的活檢中培養出來的。在活檢之前，所有患者都獲得了參與研究的知情同意書。根據先前報告的結果確定培養條件。分離的切片標本在含有甲氧芐啶(5 µg/mL)、萬古黴素(10 µg/mL) 和兩性黴素B (2.5 µg/mL) 的布魯氏菌瓊脂（默克，德國）上培養，並補充5% 羊血。

在37°C（CO2：10%）微需氧條件下培養3-5天后，透過常規微生物測試（包括革蘭氏染色以及氧化酶、脲酶和過氧化氫酶測試）將生長的細菌鑑定為幽門螺旋桿菌。為了進一步評估，我們使用 pET-32a 和 pBSK 載體（Novagen Inc.，美國）。此外，pET-32a載體用於產生帶有6-組胺酸標籤和N端T7表位標籤的融合蛋白。這些額外的氨基酸使產生的蛋白質的重量增加了多達 20 kDa。本研究中，限制性內切酶和DNA連接酶購自Fermentas（立陶宛），大腸桿菌DH5α菌株（Stratagene，美國）用於初始克隆。此外，將重組pET-32a（pET-32a UreB）轉殖至大腸桿菌BL21（DE3）pLysS（Novagen，美國）作為細菌宿主菌株。對於常規細菌培養，我們使用 Lysogeny 肉湯（Luria-Bertani 肉湯，LB；Sigma，美國）。將所需的抗生素，包括氨芐西林 (100 µg/mL) 和氯黴素 (34 µg/mL；Sigma，美國) 加入 LB 培養基中。

結果： PCR定序結果顯示UreB基因克隆到重組質粒。透過異丙基 β-D 硫代半乳糖苷 (IPTG) 誘導蛋白質的產生，並使用 Ni-NTA 試劑盒透過透析純化表達的蛋白質。此外，Western blotting中抗體辨識了分子量為42 kDa的重組蛋白。

結論：透過免疫生物資訊預測，抗體的評估顯示免疫原性片段具有高抗原特性。因此，UreB重組蛋白可能是開發幽門螺旋桿菌疫苗和其他診斷試劑盒的合適抗原。